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酵母质粒小提试剂盒(1~5mL)图片
产品货号:
WH0039
中文名称:
酵母质粒小提试剂盒(1~5mL)
英文名称:
Yeast Plasmid DNA Mini Kit (1-5mL)
产品规格:
50次
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价
本试剂盒对普通的碱裂解法进行了改进,可快速得到高纯质粒DNA,并祛除基因组DNA。通过离心吸附柱吸附、洗涤DNA,方便快速,不需使用有毒有害试剂,可同时处理多个样品。除适用于酵母细胞外,也可用于大肠杆菌。质粒得率与酵母菌株、质粒拷贝数、培养条件等因素有关。

试剂盒组成:
组分50T
平衡液BL30mL
溶液YP115mL
溶液YP215mL
溶液YP320mL
去蛋白液PD30mL
漂洗液PW15mL
洗脱缓冲液EB15mL
RNaseA(10mg/ml)150μL
吸附柱CP250个
收集管(2mL)50个


保存条件:
室温(15~25℃)干燥条件下,可保存12个月,更长时间的保存可置于2~8℃。2~8℃保存条件下,若溶液产生沉淀,使用前应将试剂盒内的溶液在室温放置一段时间,必要时可在37℃水浴中预热10min,以溶解沉淀。溶液YP1加入RNase A后,应置于2~8℃,可稳定保存6个月。单独包装的RNase A可在室温保存12个月。

需要自备的试剂:

Lyticase(货号:WH0216)
山梨醇buffer:用0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.4)配制1.2M山梨醇
          0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.4)的配制:
          77.4mL 0.1mol/L Na2HPO4+22.6mL 0.1mol/L NaH2PO4

注意事项:(请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项)
  • 溶液YP1使用前先加入RNaseA (将试剂盒中提供的RNase A全部加入),混匀,置于2~8℃保存。
  • 使用前先检查平衡液BL、溶液YP2和YP3是否出现浑浊,如有混浊现象,可置于37℃水浴中加热几分钟,即可恢复澄清。
  • 溶液YP2和YP3使用后应立即盖紧盖子。
  • 所有离心步骤均为使用台式离心机室温下进行离心,速度为12000rpm (~13400×g)。
  • 提取的质粒量与酵母菌的培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。
  • 实验前使用平衡液处理吸附柱,可以最大限度激活硅基质膜,提高得率。
  • 用平衡液处理过的柱子最好当天使用,放置时间过长会影响效果。


使用方法:
使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇,加入体积请参照瓶上的标签。

  • 柱平衡步骤:向吸附柱CP2中(吸附柱放入收集管中)加入500μL的平衡液BL,12000rpm(~13400×g)离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。(请使用当天处理过的柱子)
  • 取1~5mL酵母培养物(不超过5×107酵母细胞),12000rpm (~13400×g)离心1min,尽量吸除上清(菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。
  • 酵母细胞壁的破除:
    • 酶法:向菌体中加入300μL山梨醇buffer,加入大约50U Lyticase,充分混匀,并在摇床上220rpm,30℃处理1h。4000rpm(~1500×g)离心10min,弃上清,收集沉淀。加入250μL溶液YP1(请先检查是否已加入RNase A)重悬沉淀。
      注意:以上Lyticase的用量和处理时间为经验值,根据酵母菌株和酵母细胞数量的不同,所用Lyticase的浓度和孵育时间应该进行适当调整。
    • 玻璃珠法:向菌体中加入250μL溶液YP1(请先检查是否已加入RNase A)重悬沉淀,彻底悬浮菌体。加入0.1g直径为0.45~0.55mm的酸洗玻璃珠,涡旋振荡10min。

  • 向管中加入250μL溶液YP2,温和地上下翻转6~8次使菌体充分混匀,室温放置5~10min。
    注意:温柔混匀,不要剧烈震荡,以免污染基因组DNA。此时菌液应变得清亮粘稠。
  • 向管中加入350μL溶液YP3,立即温和地上下翻转6~8次,充分混匀,此时会出现白色絮状沉淀。12000rpm (~13400×g)离心20min。
    注意:YP3加入后应立即混合,避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀,可再次离心后取上清。
  • 小心地将上清液加入吸附柱CP2中(吸附柱放入收集管中),12000rpm (~13400×g)离心1min,倒掉废液,将吸附柱CP2放入收集管中。
  • 向吸附柱CP2中加入500μL缓冲液PD,12000rpm (~13400×g)离心1min,倒掉废液。
  • 向吸附柱CP2中加入600μL漂洗液PW(请先检查是否已加入无水乙醇),12000rpm(~13400×g)离心1min,倒掉废液,将吸附柱CP2放入收集管中。
  • 重复操作步骤8。
  • 将吸附柱CP2放入收集管中置于12000rpm (~13400×g)离心2min,目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。
    注意:漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响,建议将吸附柱CP2开盖,置于室温放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
  • 将吸附柱CP2置于一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位滴加50~100μL洗脱缓冲液EB,室温放置2min,12000rpm (~13400×g)离心2min将质粒溶液收集到离心管中。
    注意:洗脱缓冲液体积不应少于50μL,体积过小影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若后续做测序,需使用ddH2O做洗脱液,并保证其pH值在7.0~8.5范围内,pH值低于7.0会降低洗脱效率。且DNA产物应保存在-20℃,以防DNA降解。为了增加质粒的回收效率,可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,再次离心。


补充说明:
  • 通常酵母质粒拷贝数都很低,一般通过电泳或者分光光度计法都很难检测到。提取的质粒如果用于下一步实验,通常建议使用量为:
    可使用1~5μL用作PCR模板。
    可使用5~10μL用于转化大肠杆菌。
  • 转化大肠杆菌时应使用商业化高转化效率的感受态细胞,如我公司公司的货号为WH0190WH0189等产品。

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